Siedem technologii do obserwowania w 2023 r. [ANG]

Kolejny art. z Nature z przewidywaniami na rok 2023.

ORYGINALNY LINK https://www.nature.com/articles/d41586-023-00178-y

artykuł przetłumaczony automatycznie przez DeepL

Od sekwencjonowania białek do mikroskopii elektronowej i od archeologii do astronomii - oto siedem technologii, które prawdopodobnie wstrząsną nauką w nadchodzącym roku.

Sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek białek

Proteom reprezentuje kompletny zestaw białek wytwarzanych przez komórkę lub organizm i może być źródłem głębokich informacji na temat zdrowia i choroby, ale jego scharakteryzowanie pozostaje wyzwaniem.

Białka są zbudowane z większego alfabetu bloków konstrukcyjnych niż kwasy nukleinowe, z około 20 naturalnie występującymi aminokwasami (w porównaniu z czterema nukleotydami, które tworzą cząsteczki takie jak DNA i messenger RNA); skutkuje to znacznie większą różnorodnością chemiczną. Niektóre z nich występują w komórce w postaci zaledwie kilku cząsteczek - i w przeciwieństwie do kwasów nukleinowych, białka nie mogą być wzmacniane, co oznacza, że metody analizy białek muszą pracować z każdym dostępnym materiałem.

Większość analiz proteomicznych wykorzystuje spektrometrię masową, technikę, która profiluje mieszaniny białek na podstawie ich masy i ładunku. Profile te mogą określać ilościowo tysiące białek jednocześnie, ale wykryte cząsteczki nie zawsze mogą być jednoznacznie zidentyfikowane, a białka o niskiej liczebności w mieszaninie są często pomijane. Teraz na horyzoncie mogą pojawić się technologie jednocząsteczkowe, które mogą sekwencjonować wiele, jeśli nie wszystkie białka w próbce - wiele z nich jest analogicznych do technik stosowanych w przypadku DNA.

Edward Marcotte, biochemik z Uniwersytetu Teksańskiego w Austin, pracuje nad jedną z takich metod, znaną jako fluorosekwencjonowanie. Technika Marcotte'a, zgłoszona w 2018 r., opiera się na stopniowym procesie chemicznym, w którym poszczególne aminokwasy są znakowane fluorescencyjnie, a następnie ścinane jeden po drugim z końca białka sprzężonego z powierzchnią, gdy kamera rejestruje powstały sygnał fluorescencyjny. "Mogliśmy oznakować białka różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, a następnie obserwować cząsteczka po cząsteczce, jak je odcinamy" - wyjaśnia Marcotte. W zeszłym roku badacze z Quantum-Si, firmy biotechnologicznej z Guilford w stanie Connecticut, opisali alternatywę dla fluorosekwencjonowania, która wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie białka "wiążące" do rozpoznawania specyficznych sekwencji aminokwasów (lub polipeptydów) na końcach białek.

Inni badacze opracowują techniki emulujące sekwencjonowanie DNA oparte na nanoporach, profilując polipeptydy na podstawie zmian, jakie wywołują w prądzie elektrycznym podczas przechodzenia przez maleńkie kanały. Biofizyk Cees Dekker z Delft University of Technology w Holandii i jego współpracownicy zademonstrowali jedno z takich podejść w 2021 r., wykorzystując nanopory wykonane z białka, i byli w stanie rozróżnić poszczególne aminokwasy w polipeptydzie przechodzącym przez por3. A w Technion - Israel Institute of Technology w Hajfie zespół inżyniera biomedycznego Amita Mellera bada półprzewodnikowe urządzenia nanoporowe wytwarzane z materiałów na bazie krzemu, które mogłyby umożliwić wysokoprzepustowe analizy wielu pojedynczych cząsteczek białka jednocześnie. "Można by było oglądać dziesiątki tysięcy lub nawet miliony nanoporów jednocześnie" - mówi.

Chociaż sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek białek jest obecnie tylko dowodem koncepcji, komercjalizacja nadchodzi szybko. Quantum-Si ogłosiło na przykład plany dostarczenia w tym roku instrumentów pierwszej generacji, a Meller zauważa, że na konferencji poświęconej sekwencjonowaniu białek w Delft w listopadzie 2022 r. odbył się panel dyskusyjny poświęcony start-upom w tej dziedzinie. "Przypomina mi to bardzo wczesne dni przed sekwencjonowaniem DNA następnej generacji" - mówi.

Marcotte, który współzałożył firmę Erisyon zajmującą się sekwencjonowaniem białek w Austin w Teksasie, jest uparty. "To naprawdę nie jest kwestia tego, czy to zadziała", mówi, "ale jak szybko znajdzie się w rękach ludzi".

Kosmiczny Teleskop Jamesa Webba

Astronomowie rozpoczęli ubiegły rok na krawędziach swoich zbiorowych foteli. Po trwającym ponad dwie dekady procesie projektowania i budowy, NASA - we współpracy z europejską i kanadyjską agencją kosmiczną - z powodzeniem wyniosła na orbitę 25 grudnia 2021 roku Kosmiczny Teleskop Jamesa Webba (JWST). Świat musiał czekać przez prawie siedem miesięcy, gdy instrument rozkładał się i orientował do swojej pierwszej rundy obserwacji.

Warto było czekać. Matt Mountain, astronom ze Space Telescope Science Institute w Baltimore w stanie Maryland, który jest naukowcem teleskopu JWST, mówi, że wstępne obrazy przekroczyły jego wzniosłe oczekiwania. "Właściwie nie ma pustego nieba - wszędzie są tylko galaktyki" - mówi. "Teoretycznie wiedzieliśmy o tym, ale zobaczyć to, emocjonalny wpływ jest zupełnie inny".

JWST został zaprojektowany, aby podnieść się tam, gdzie zakończył pracę Kosmiczny Teleskop Hubble'a. Hubble generował oszałamiające widoki Wszechświata, ale miał ślepe miejsca: starożytne gwiazdy i galaktyki z sygnaturami świetlnymi w zakresie podczerwieni były dla niego zasadniczo niewidoczne. Aby to naprawić, potrzebny był instrument o czułości pozwalającej na wykrycie niewiarygodnie słabych sygnałów podczerwonych pochodzących z odległości miliardów lat świetlnych.

Ostateczny projekt JWST zawiera układ 18 idealnie gładkich berylowych luster, które po całkowitym rozłożeniu mają średnicę 6,5 metra. Tak precyzyjnie zaprojektowano te lustra, mówi Mountain, że "gdyby rozciągnąć segment na obszarze Stanów Zjednoczonych, żadna nierówność nie mogłaby być większa niż kilka cali [wysokości]". Są one sprzężone z najnowocześniejszymi detektorami bliskiej i średniej podczerwieni.

Taka konstrukcja pozwala JWST wypełnić luki Hubble'a, w tym uchwycić sygnatury z galaktyki sprzed 13,5 miliarda lat, która wyprodukowała jedne z pierwszych atomów tlenu i neonu we Wszechświecie. Teleskop przyniósł również kilka niespodzianek, na przykład możliwość zmierzenia składu atmosfery niektórych klas egzoplanet.

Naukowcy z całego świata ustawiają się w kolejce po czas obserwacji. Mikako Matsuura, astrofizyk z Cardiff University w Wielkiej Brytanii, prowadzi dwa badania z JWST, przyglądając się tworzeniu i niszczeniu kosmicznego pyłu, który może przyczynić się do formowania gwiazd i planet. "To zupełnie inny rząd czułości i ostrości" w porównaniu z teleskopami, których jej grupa używała w przeszłości, mówi Matsuura. "Widzieliśmy zupełnie inne zjawiska trwające wewnątrz tych obiektów - to niesamowite".

Mikroskopia elektronowa objętościowa

Mikroskopia elektronowa (EM) znana jest z doskonałej rozdzielczości, ale głównie na poziomie powierzchni próbek. Schodzenie głębiej wymaga rzeźbienia okazu w wyjątkowo cienkie plastry, które dla biologów są często niewystarczające do wykonania zadania. Lucy Collinson, mikroskopista elektronowy w Francis Crick Institute w Londynie, wyjaśnia, że pokrycie objętości tylko jednej komórki może wymagać 200 przekrojów. "Jeśli otrzymujesz tylko jeden [przekrój], grasz w grę statystyczną" - mówi.

Obecnie badacze wprowadzają rozdzielczość EM do próbek tkanek 3D obejmujących wiele milimetrów sześciennych.

Wcześniej rekonstrukcja takich objętości z dwuwymiarowych obrazów EM - na przykład w celu określenia połączeń neuronowych w mózgu - wymagała żmudnego procesu przygotowania próbki, obrazowania i obliczeń w celu przekształcenia tych obrazów w stos wielu obrazów. Najnowsze techniki "objętościowej EM" obecnie drastycznie usprawniają ten proces.

Techniki te mają różne zalety i ograniczenia. Seryjne obrazowanie powierzchni bloków, w którym wykorzystuje się diamentowe ostrze do usuwania cienkich, kolejnych warstw próbki osadzonej w żywicy podczas obrazowania, jest stosunkowo szybkie i może obsługiwać próbki o wielkości zbliżonej do jednego milimetra sześciennego. Jednakże, oferuje ona słabą rozdzielczość głębokościową, co oznacza, że wynikowa rekonstrukcja objętości będzie stosunkowo niewyraźna. Skaningowa mikroskopia elektronowa zogniskowanej wiązki jonów (FIB-SEM) pozwala na uzyskanie znacznie cieńszych warstw - i tym samym lepszą rozdzielczość głębokościową - ale lepiej nadaje się do próbek o mniejszej objętości.

Collinson opisuje powstanie EM objętościowej jako "cichą rewolucję", w której badacze podkreślają raczej wyniki tego podejścia niż techniki użyte do ich uzyskania. Jednak to się zmienia. Na przykład w 2021 roku badacze pracujący nad inicjatywą Cell Organelle Segmentation in Electron Microscopy (COSEM) w Janelia Research Campus w Ashburn w stanie Wirginia opublikowali w Nature parę prac podkreślających znaczny postęp w mapowaniu wnętrza komórki4,5. "To bardzo imponujący dowód na zasadę działania" - mówi Collinson.

Inicjatywa COSEM wykorzystuje zaawansowane, dostosowane do potrzeb mikroskopy FIB-SEM, które zwiększają objętość, jaką można zobrazować w jednym eksperymencie około 200-krotnie, zachowując przy tym dobrą rozdzielczość przestrzenną. Używając banku tych maszyn w połączeniu z algorytmami głębokiego uczenia, zespół był w stanie zdefiniować różne organelle i inne struktury subkomórkowe w pełnej objętości 3D szerokiej gamy typów komórek.

Metody przygotowania próbek są pracochłonne i trudne do opanowania, a uzyskane w ten sposób zbiory danych są ogromne. Ale wysiłek się opłaca: Collinson już teraz dostrzega zalety badań nad chorobami zakaźnymi i biologią nowotworów. Obecnie współpracuje z kolegami, aby zbadać możliwość zrekonstruowania całego mózgu myszy w wysokiej rozdzielczości - wysiłek ten, jak przewiduje, zajmie ponad dekadę pracy, będzie kosztował miliardy dolarów i przyniesie pół miliarda gigabajtów danych. "To prawdopodobnie jest tego samego rzędu wielkości, co wysiłek związany z mapowaniem pierwszego ludzkiego genomu" - mówi.

CRISPR wszędzie

Narzędzie do edycji genomu CRISPR-Cas9 słusznie zyskało reputację metody umożliwiającej wprowadzanie określonych zmian w wybranych miejscach genomu, co przyczyniło się do przełomu w terapii genowej, modelowaniu chorób i innych dziedzinach badań. Istnieją jednak ograniczenia co do miejsc, w których można ją stosować. Teraz badacze znajdują sposób na obejście tych ograniczeń.

Edycja CRISPR jest koordynowana przez krótki RNA prowadzący, który kieruje związany z nim enzym nukleazę Cas do docelowej sekwencji genomu. Jednak enzym ten wymaga również pobliskiej sekwencji zwanej protospacer adjacent motif (PAM); bez niej edycja może się nie powieść.

W Massachusetts General Hospital w Bostonie, inżynier genomu Benjamin Kleinstiver wykorzystał inżynierię białek do stworzenia "prawie bez-PAM-owych" wariantów Cas powszechnie używanego enzymu Cas9 z bakterii Streptococcus pyogenes. Jeden z wariantów Cas wymaga PAM składającego się z zaledwie trzech kolejnych zasad nukleotydowych z nukleotydem A lub G w pozycji środkowej6. "Enzymy te czytają teraz praktycznie cały genom, podczas gdy konwencjonalne enzymy CRISPR czytają wszędzie od 1% do 10% genomu" - mówi Kleinstiver.

Takie mniej rygorystyczne wymagania PAM zwiększają szanse na edycje "off-target", ale dalsza inżynieria może poprawić ich specyficzność. Jako alternatywne podejście, zespół Kleinstivera opracowuje i testuje dużą liczbę wariantów Cas9, z których każdy wykazuje wysoką specyficzność dla różnych sekwencji PAM.

Istnieje również wiele naturalnie występujących wariantów Cas, które pozostają do odkrycia. W naturze system CRISPR-Cas9 jest bakteryjnym mechanizmem obronnym przed infekcją wirusową, a różne mikroorganizmy wyewoluowały różne enzymy o odmiennych preferencjach PAM. Wirusolog Anna Cereseto i badacz mikrobiomu Nicola Segata z Uniwersytetu w Trento we Włoszech przeczesali ponad milion genomów bakteryjnych, aby zidentyfikować i scharakteryzować zróżnicowany zestaw wariantów Cas9, które według ich szacunków mogłyby łącznie objąć ponad 98% znanych mutacji powodujących choroby u ludzi.

Jednak tylko garstka z nich będzie działać w komórkach ssaków. "Nasz pomysł polega na przetestowaniu wielu z nich i sprawdzeniu, jakie są czynniki, które sprawiają, że te enzymy działają prawidłowo" - mówi Cereseto. Kleinstiver mówi: "Myślę, że w końcu będziemy mieli całkiem kompletny zestaw narzędzi, które pozwolą nam edytować każdą bazę, którą chcemy".

Precyzyjne datowanie radiowęglowe

W zeszłym roku archeolodzy wykorzystali postępy w datowaniu radiowęglowym, aby ustalić dokładny rok - a nawet porę roku - w której odkrywcy Wikingów po raz pierwszy dotarli do obu Ameryk. Pracując z kawałkami ściętego drewna odnalezionymi w osadzie na północnym brzegu Nowej Fundlandii w Kanadzie, zespół pod kierownictwem eksperta w dziedzinie analizy izotopowej Michaela Dee z Uniwersytetu w Groningen w Holandii i jego doktorantki Margot Kuitems ustalił, że drzewo zostało prawdopodobnie ścięte w roku 1021, prawdopodobnie wiosną.

Naukowcy od lat 40. XX wieku wykorzystują datowanie radiowęglowe artefaktów organicznych do zawężania dat wydarzeń historycznych. Robią to, mierząc ślady izotopu węgla-14, który powstaje w wyniku oddziaływania promieni kosmicznych z atmosferą Ziemi i który rozpada się powoli przez tysiąclecia. Jednak technika ta jest zwykle precyzyjna tylko do kilku dekad.

Sytuacja zmieniła się w 2012 r., gdy naukowcy pod kierownictwem fizyka Fusa Miyake z Uniwersytetu Nagoya w Japonii wykazali9, że mogą datować charakterystyczny skok poziomu węgla-14 w słojach japońskiego drzewa cedrowego na lata 774-5. Kolejne badania nie tylko potwierdziły, że taki skok był obecny w próbkach drewna na całym świecie z tego okresu, ale także zidentyfikowały co najmniej pięć innych takich skoków datowanych na 7176 rok p.n.e. Naukowcy powiązali te kolce z aktywnością burzy słonecznej, ale ta hipoteza jest wciąż badana.

Niezależnie od przyczyny, te "wydarzenia Miyake" pozwalają naukowcom na precyzyjne określenie roku, w którym powstały drewniane artefakty, poprzez wykrycie konkretnego wydarzenia Miyake, a następnie policzenie pierścieni, które uformowały się od tego czasu. Naukowcy mogą nawet ustalić sezon, w którym drzewo zostało ścięte, na podstawie grubości najbardziej zewnętrznego pierścienia - mówi Kuitems.

Archeolodzy stosują obecnie to podejście do osad neolitycznych i miejsc erupcji wulkanów, a Dee ma nadzieję wykorzystać je do badania imperium Majów w Mezoameryce. W ciągu następnej dekady Dee jest optymistą, że "będziemy mieć naprawdę absolutne zapisy dla wielu z tych starożytnych cywilizacji z dokładnością do roku i będziemy mogli mówić o ich rozwoju historycznym ... w naprawdę precyzyjnej skali".

Co do Miyake, jej poszukiwania historycznych mierników trwają nadal. "Szukamy teraz innych skoków węgla-14 porównywalnych z wydarzeniem 774-5 w ciągu ostatnich 10 000 lat", mówi.

Metabolomika pojedynczych komórek

Metabolomika - badanie lipidów, węglowodanów i innych małych cząsteczek, które napędzają komórkę - była początkowo zestawem metod do charakteryzowania metabolitów w populacji komórek lub tkanek, ale obecnie przenosi się na poziom pojedynczych komórek. Naukowcy mogliby wykorzystać takie dane na poziomie komórkowym do rozplątania funkcjonalnej złożoności w ogromnych populacjach pozornie identycznych komórek. Jednak przejście to wiąże się z poważnymi wyzwaniami.

Metabolom obejmuje ogromną liczbę cząsteczek o różnych właściwościach chemicznych. Niektóre z nich są bardzo ulotne, z szybkością obrotu poniżej sekundy, mówi Theodore Alexandrov, badacz zajmujący się metabolomiką w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej w Heidelbergu, Niemcy. I mogą być trudne do wykrycia: podczas gdy sekwencjonowanie RNA w pojedynczej komórce może uchwycić blisko połowę wszystkich cząsteczek RNA wytwarzanych w komórce lub organizmie (transkryptom), większość analiz metabolomicznych obejmuje tylko niewielki ułamek metabolitów komórki. Te brakujące informacje mogą zawierać kluczowe spostrzeżenia biologiczne.

"Metabolom to tak naprawdę aktywna część komórki" - mówi Jonathan Sweedler, chemik analityczny z University of Illinois w Urbana-Champaign. "Kiedy masz chorobę, jeśli chcesz poznać stan komórki, naprawdę chcesz spojrzeć na metabolity".

Wiele laboratoriów metabolomicznych pracuje ze zdysocjowanymi komórkami, które wychwytują w kapilarach i analizują indywidualnie za pomocą spektrometrii masowej. Natomiast metody "obrazowania spektrometrii masowej" wychwytują przestrzenne informacje o tym, jak produkcja metabolitów komórkowych zmienia się w różnych miejscach próbki. Na przykład, badacze mogą wykorzystać technikę zwaną desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), w której wiązka laserowa przesuwa się po specjalnie przygotowanym wycinku tkanki, uwalniając metabolity do późniejszej analizy za pomocą spektrometrii masowej. Pozwala to również na uchwycenie współrzędnych przestrzennych, z których pochodzą metabolity w próbce.

Teoretycznie, obie metody mogą określać ilościowo setki związków w tysiącach komórek, ale osiągnięcie tego celu wymaga zazwyczaj najwyższej klasy, dostosowanego sprzętu, którego koszt waha się w granicach miliona dolarów, mówi Sweedler.

Teraz badacze demokratyzują tę technologię. W 2021 roku grupa Alexandrova opisała SpaceM, otwarte narzędzie programowe, które wykorzystuje dane obrazowe z mikroskopii świetlnej, aby umożliwić przestrzenne profilowanie metabolomiczne hodowanych komórek przy użyciu standardowego komercyjnego spektrometru masowego11. "My w pewnym sensie wykonaliśmy ciężką pracę w części dotyczącej analizy danych" - mówi.

Zespół Alexandrova wykorzystał SpaceM do profilowania setek metabolitów z dziesiątek tysięcy komórek ludzkich i mysich, wykorzystując standardowe metody transkryptomiczne dla pojedynczych komórek, aby sklasyfikować je w grupy. Alexandrov mówi, że jest szczególnie entuzjastycznie nastawiony do tego ostatniego aspektu i pomysłu składania "atlasów metabolomicznych" - analogicznych do tych opracowanych dla transkryptomiki - aby przyspieszyć postęp w tej dziedzinie. "To jest zdecydowanie granica i będzie to duży czynnik umożliwiający", mówi.

Modele zarodków in vitro

Droga od zapłodnionej komórki jajowej do w pełni ukształtowanego zarodka została szczegółowo opisana na poziomie komórkowym u myszy i ludzi. Jednak mechanizm molekularny napędzający wczesne etapy tego procesu pozostaje słabo poznany. Obecnie intensywne prace nad modelami embrionalnymi pomagają wypełnić te luki, dając naukowcom jaśniejszy obraz istotnych wczesnych wydarzeń, które mogą decydować o sukcesie lub porażce rozwoju płodu.

Niektóre z najbardziej zaawansowanych modeli pochodzą z laboratorium Magdaleny Zernickiej-Goetz, biologa rozwojowego w Kalifornijskim Instytucie Technologii w Pasadenie i na Uniwersytecie Cambridge w Wielkiej Brytanii. W 2022 r. ona i jej zespół wykazali, że mogą generować zarodki mysie w stadium implantacji w całości z embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Podobnie jak wszystkie pluripotencjalne komórki macierzyste, komórki ES mogą tworzyć dowolny typ komórki lub tkanki - ale wymagają ścisłej interakcji z dwoma typami komórek pozazarodkowych, aby ukończyć normalny rozwój zarodka. Zespół Zernickiej-Goetz nauczył się, jak nakłonić komórki ES do tworzenia tych komórek pozazarodkowych i wykazał, że mogą one być współkulturowane z komórkami ES w celu uzyskania modeli zarodków dojrzewających do etapów, które wcześniej były nieosiągalne in vitro. "Jest to tak wierny model embrionalny, jak tylko można sobie wyobrazić" - mówi Zernicka-Goetz. "Rozwija się w nim głowa i serce - i to bijące". Jej zespół był w stanie wykorzystać ten model do ujawnienia, jak zmiany w poszczególnych genach mogą wykoleić normalny rozwój embrionalny.

W Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, biolog zajmujący się komórkami macierzystymi Miguel Esteban i współpracownicy obierają inną drogę: przeprogramowują ludzkie komórki macierzyste w celu modelowania najwcześniejszych etapów rozwoju.

"Zaczęliśmy od pomysłu, że właściwie to może być nawet możliwe stworzenie zygot" - mówi Esteban. Zespołowi nie udało się tego osiągnąć, ale zidentyfikowali strategię hodowli, która sprawiła, że komórki macierzyste powróciły do stanu przypominającego ośmiokomórkowe ludzkie embriony. Jest to kluczowy etap rozwoju, związany z ogromną zmianą w ekspresji genów, która ostatecznie daje początek odrębnym liniom komórek zarodkowych i pozazarodkowych.

Choć niedoskonały, model Estebana wykazuje kluczowe cechy komórek w naturalnych zarodkach ośmiokomórkowych i uwypuklił ważne różnice między tym, jak zarodki ludzkie i mysie inicjują przejście do etapu ośmiokomórkowego. "Zobaczyliśmy, że czynnik transkrypcyjny, który nie ulega nawet ekspresji u myszy, reguluje całą konwersję" - mówi Esteban.

Łącznie, modele te mogą pomóc naukowcom w mapowaniu, jak zaledwie kilka komórek daje początek oszałamiającej złożoności ciała kręgowców.

W wielu krajach badania na ludzkich embrionach są ograniczone po 14 dniach rozwoju, ale w ramach tych ograniczeń naukowcy mogą zrobić wiele. Modele zwierząt naczelnych stanowią jedną z możliwych alternatyw, mówi Esteban, a Zernicka-Goetz mówi, że jej strategia mysich embrionów może również generować ludzkie embriony, które rozwijają się aż do 12 dnia. "Wciąż mamy wiele pytań do zadania na tym etapie, który możemy swobodnie badać" - mówi.

#nauka #technologia #biologia #kosmos #astronomia #medycyna #nature #gruparatowaniapoziomu